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生物显微镜的内反射荧光技术原理

来源:  发布时间:2019-01-03   点击量:187

生物显微镜的内反射荧光技术利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像,从而实现对生物样品观测的一种新生技术。由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高时间分辨率,因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。

利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像,从而实现对生物样品观测的一种新生技术。由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高时间分辨率,因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。

全内反射荧光显微镜根据其结构的不同可分为目镜型和棱镜型两种。

1.棱镜型全内反射荧光显微镜

棱镜型全内反射荧光显微镜就是利用激光经过棱镜并产生全内反射,其消逝波照射已被荧光标记的生物样品,其激发光从另一侧进入目镜,并被CCD相机捕捉,其光路图如图所示。

从光路图我们可以看出,棱镜型系统在实现上更加容易,它只需要激光光源、棱镜和显微镜,它也不容易受到入射光信号的干扰,但由于消逝波在z轴方向上呈指数衰减,只能照射100nm的距离。在探测上,放置样品的空间收到棱镜的限制。另外由于目镜和物镜同样品距离近,因此同其他仪器的配合也受到限制。目前棱镜型全内反射荧光显微镜的发展很慢,在科学研究中一般很少用到。

2.物镜型全内反射显微镜

在物镜型全内反射显微术中,显微镜的物镜即作为收集样品荧光信号的接收器,同时又作为发生全内反射的光学器件,如图所示。

由于细胞的典型折射率为1.33~1.38 ,因此要想实现全内反射,物镜的NA必须大于1.38。表达式为:

NA = nsinθ,nsinθ> nsinθc

NA为物镜的数值孔径,n、θ分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全反射的临界角。当我们使用NA值为1. 4 的透镜物镜时,只有很小的一部分物镜孔径范围(1.4 -1.38=0.02)可以被利用,这显然增加了光束校准的难度,同时光束的强度也很难提高。如果我们使用NA=1. 65的透镜物镜,则有一个大的多的孔径范围(1.65-1.38=0.27)可被利用,即有更多的激发光强可以用来产生全反射。

物镜型的全内反射荧光显微镜在制作要求的技术很高,它是近年来全内反射荧光显微镜的发展方向,由于它的物镜同收集样品荧光的仪器在同一侧,这有助于同其他的仪器等的结合。

内反射荧光显微镜的优势应用和发展展望:

全内反射荧光显微镜里用消逝波作为阳品的激发光源,并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机捕捉样品荧光,因此具有如下优点:

1.信噪比高(相对共聚焦显微镜);

2.分辨率高(相对其他的光学显微镜);

3.对生物样本损伤小(相对电镜),可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。

全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在~100nm的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。

全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求;另一方面它的图像解释相对于近场,干涉显微成像来说也较简单。


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